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| Worum geht es? Um die Nanopartikel für die Zellbiologie nutzen zu können, genügt es nicht, sie an Proteine von Interesse zu koppeln. Vielmehr muß man sie zuerst einmal in lebende Zellen hineinbringen. Bei Pflanzenzellen stellt sich diese Aufgabe in besonderer Schärfe - hier muß man nicht nur die Plasmamembran durchdringen, sondern zusätzlich noch eine recht derbe Zellwand, die aus Cellulose besteht. Als "Versuchskaninchen" benutzen wir Tabakzellen, die wir in einer Flüssigkultur halten. Diese Zellen sind sehr groß, teilen sich schnell und daher für zellbiologische Untersuchungen gut geeignet.
Wir haben zunächst versucht, die Nanoteilchen mithilfe von Überdruck in lebende Pflanzenzellen hineinzuschießen. Dazu wurde Goldstaub mit diesen Teilchen beschichtet und dann mit einer sogenannten Partikelkanone in die Tabakzellen eingebracht. Dieses Verfahren wurde ursprünglich für fremde DNS entwickelt, die dann in der Zielzelle abgelesen und in Protein übersetzt wird. Das Bild zeigt eine Zelle, in die DNS für das Actinbindeprotein Arp3 hineingeschossen wurde. Das Arp3-Gen war mit dem Gen für das rot fluoreszierende Quallenprotein RFP verbunden. Das Fusionsprotein kann über Fluoreszenzmikroskopie beobachtet werden.
Dieses Verfahren wurde nun für die Nanopartikel abgewandelt. Die Goldpartikel wurden nun anstelle mit DNS mit biokonjugierten Nanopartikeln beschichtet. Allerdings konnten nur wenige Zellen beobachtet werden, bei denen die (hier rote) Fluoreszenz der Partikel tatsächlich im Innern der Zelle nachweisbar war (Aufnahme Kai Eggenberger). In vielen Zellen waren zwar Goldteilchen zu sehen (z.B. in der rechten Zelle als schwarze Körner sichtbar), diese hatten aber ihre Nanopartikelfracht verloren und fluoreszierten nicht mehr. Wir vermuten, daß die Fracht beim Aufprall auf die Zellwand verlorengeht und nur das nackte Goldteilchen in die Zelle eindringt. Der Weg, die Nanopartikel in die Zellen hineinzuschießen, war also nicht erfolgreich. Wir verfolgen daher zwei alternative Strategien:
Trojanische Peptide sind in der Lage, in Biomembranen Poren zu bilden, durch die dann auch größere Moleküle (z.B. Nanopartikel) in die Zelle hineingelangen können - ähnlich wie das Holzpferd des Odysseus den Griechen dazu diente, heimlich in die Stadt Troja einzudringen. Hier stellen sich jedoch zwei Probleme: 1. Die Poren müssen sich hinterher wieder schließen, sonst ist die Zelle nicht mehr in der Lage, ihren Innenraum chemisch und energetisch zu steuern und stirbt. 2. Die Poren dürfen sich nur in der Plasmamembran bilden, auf keinen Fall in anderen Membranen der Zelle. Bei Pflanzenzellen besonders heikel ist die von der Tonoplastenmembran umgebene Vacuole - würde der Tonoplast durchlöchert, würde die sehr saure und mit für die Zelle tödlichen Substanzen (z.B. Polyphenolen) gefüllte Vacuole sich in das Cytoplasma ergießen und die Proteine sofort zum Gerinnen bringen, was den sofortigen Zelltod zur Folge hätte.
Wir haben ausserdem ein Testsystem entwickelt, dass es uns erlaubt, die Größe der so erzeugten Poren zu bestimmen. Wir können Poren erzeugen, durch die Moleküle von knapp 10 kDa Molekulargewicht in die Tabakzellen hineingelangen. Das reicht schon für kleinere Proteine, ist aber noch nicht ausreichend, um fluoreszierende Nanopartikel in die Pflanzenzelle hineinzuschleusen. Im nächsten Schritt geht es nun darum, diese Peptide so abzuwandeln, dass größere Poren entstehen. Weg 3: Mit Elektroporation In Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Bluhm am Forschungszentrum Karlsruhe verfolgen wir derzeit einen dritten Weg. Hierbei wird die Zellwand der Pflanzenzelle mithilfe von Enzymen abverdaut und diese sogenannte Protoplasten dann einem kurzen, aber heftigen Elektroschock ausgesetzt. Auch dadurch entstehen kurzzeitig Membranporen, durch die dann auch große Moleküle eindringen können. Die wandlosen Zellen müssen vorsichtig behandelt werden, damit sie nicht platzen, man kann sie aber dazu bringen, wieder eine neue Zellwand zu bilden. Unsere Vorversuche haben ergeben, dass man auf diesem Wege grosse Proteine von bis zu 200 kDa in die Zellen einschleusen kann. Wir denken daher, das sich so auch fluoreszierende Nanopartikel in die Tabakzellen einführen lassen. Publikation Förderung Projekt LuNaCell Forschungsschwerpunkt des Landes Baden-Württemberg - Universität Karlsruhe, Universität Freiburg, Fachhochschule Offenburg Projekt E1.5 des DFG-Excellenz-Centrums für Funktionelle Nanostrukturen
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Rechte vorbehalten |
Weg
1: Mit der Partikelkanone
Auf
dem Bild (Aufnahme Jan Maisch) ist zu sehen, wie das Arp3-Protein
perlenartig entlang von (grün markierten) Actinfilamenten sitzt.
Weg
2: Mit Trojanischen Peptiden
Wir
haben darum solche Peptide gesucht, die sich nur in die äußere
Plasmamembran einlagern können und dabei den Umstand genutzt, daß sich die
Plasmamembran von der Tonoplastenmembran durch ihre Zusammensetzung
unterscheidet. Dies führt zu einer unterschiedlichen elektrischen Ladung
und dies kann tatsächlich von bestimmten Peptiden erkannt werden. Diese
lagern sich daher nur in die Plasmamembran ein und lassen die Vacuole
intakt. Auf einem langen Weg haben wir ein Verfahren entwickelt, das es
erlaubt, diese Peptide einwirken zu lassen und hinterher wieder zu
entfernen, ohne dass die Zellen Schaden nehmen. Nach einer kurzen
Erholungsphase beginnen sie wieder damit, sich zu teilen und auch das
Actinskelett, ein sehr empfindlicher Anzeiger für Zellschäden, wird durch
diese Behandlung nicht beeinträchtigt. Die Aufnahme zeigt Tabakzellen, die
nach Peptidbehandlung ein etwa 4 kDa großes fluoreszierendes Molekül
aufgenommen haben. Die Zellen sind intakt, was z.B. an dem gut sichtbaren
Kern und den ihn umgebenden Plasmasträngen erkennbar ist (Aufnahme Kai
Eggenberger).