Angewandte Biologie Modulverzeichnis Modul Ang-01C Nutzpflanzen

Materialien

Folien Vorlesung "Botanik der Nutzpflanzen - Ziele und Methoden"

Bedienungsanleitung Praktikums-mikroskop Olympus CH20

Aufbau eines Lichtmikroskops: Das von der Sockelleuchte erzeugte Licht wird über einen Spiegel von unten her durch den Kondensor zum Objekttisch geleitet. Gute Bilder gibt es nur, wenn die Position des Kondensors, die Leuchtfeldblende (im Sockel) und die Kondensorblende richtig eingestellt sind. Dieses Einstellen nennt man Köhlern und es gehört zu den Grundfertigkeiten der Mikroskopie.

Übersichtszeichnung eines Stängels mit den Leitbündeln. Es werden nur Umrisse gezeigt, keine zellulären Einzelheiten.

Einstrich-, Zweistrich- und Dreistrichtechnik.

Epidermispräparat der Küchenzwiebel (Allium cepa). Man erkennt die Zellwände und die Zellkerne. Das Innere der Zelle ist weitgehend durch die Vacuole ausgefüllt.

Hintergrund:

Wie werden neue Querwände gebildet? (pdf)

Film: Wie teilen sich pflanzliche Zellen (Achtung: 3.5 MB)

Stärkekörner im Polarisations-mikroskop. Da Stärke ein Dipol ist (aufgebaut aus 1,4-a-verknüpften Glucoseresten) gibt es mit polarisiertem Licht eine Wechselwirkung, deren Stärke von der Orientierung der (langgestreckten) Stärkemoleküle abhängt. Dies führt zu einem Gangunterschied des polarisierten Strahls, der mithilfe eines Gipsplättchens Rot als Farbumschlag sichtbar wird. Die Farben zeigen also unterschiedliche Orientierungen der Stärkemolekülen an. Die geordnete Struktur der Stärkekörner rührt daher, dass die Stärke in spezialisierten Plastiden, den Amyloplasten, gebildet wird.

Angewandte Biologie Praktikum Nutzpflanzen

Kurs 1: Grundtechniken der Lichtmikroskopie

Kursprogramm

1. Praktische Einführung in die Hellfeldmikroskopie

2. Praktische Einführung in wissenschaftliche Zeichentechnik

3. Präparat 1: Epidermiszellen der Zwiebel (Allium cepa L.)

4. Präparat 2: Histochemie von Kartoffelstärke (Solanum tuberosum L.)

1. Praktische Einführung in die Hellfeldmikroskopie

Ein paar Grundregeln:

Scharfstellen: immer vom Präparat weg nach oben, nie umgekehrt (Bruchgefahr!)

Sauberkeit: mit einem sauberen Papiertuch Okular- und Objektivfrontlinsen ab und zu reinigen. Nicht mit den Fingern auf die Frontlinse der Objektive fassen.

Objektivwechsel: an der Rändelschraube drehen, nicht am Objektiv festhalten (wenn es sich verzieht, stimmt die Optik nicht mehr).

Köhlern: Präparat scharfstellen, Leuchtfeldblende schließen, man sieht eine Irisblende, Kondensorhöhe so einstellen, daß diese Irisblende scharf erscheint, Kondensorblende so einstellen, daß der Kontrast gut ist.

Vergrößerung und Auflösungsvermögen des Lichtmikroskops

Bedeutung der Zahlenangaben auf den Okularen:

10x = Vergrößerung des Okulars, 18 = Feldzahl (Durchmesser der Sehfeldblende in mm) dient zur Berechnung des Durchmessers des beobachteten Objektausschnitts (Dingfelddurchmesser):

Dingfelddurchmesser = Feldzahl / (Vergrößerung des Objektivs x Tubusfaktor)

Beispiel: für das 40x Objektiv ergibt sich 18 mm / 40 x 1 und damit 0,45 mm (450 µm), d.h. das gesamte Sehfeld mißt in Wirklichkeit 450 µm.

Bedeutung der Zahlenangaben auf den Objektiven:

40x = Vergrößerung des Objektives

0,65 = numerische Apertur (n∙sin α)

Die numerische Apertur A ist eine Kenngröße für das Auflösungsvermögen.

α bezeichnet den Winkel zwischen der optischen Achse und dem Randstrahl des Lichtkegels, der von einem

Punkt des mikroskopisches Objekts in das Objektiv einzutreten vermag.

n = Brechzahl des Mediums zwischen Präparat und Objektiv (Brechungsindex von Luft = 1)

160 = Tubuslänge in mm

0,17 = Schichtdicke des Deckglases in mm (zur Kompensation der Deckglasabberation – “Linsenfehler“

Auflösungsvermögen und Vergrößerung:

Die Grenze des Auflösungsvermögens liegt für Lichtmikroskope bei 0,2 µm (200 nm).

→ Das menschliche Auge hat ein Auflösungsvermögen von 0,1 mm (100 µm), d.h. zwei parallele Linien, die weniger als 100 µm auseinander liegen, verschwimmen zu einem einzigen Punkt.

Unter dem Auflösungsvermögen D versteht man die Möglichkeit voneinander getrennte, sehr nahe beieinander liegende Objekteinzelheiten (Strukturen) getrennt abzubilden → Minimaler Abstand zweier Objektpunkte, die noch getrennt abgebildet werden können

D = l/A_OBJ +A_KON

l = Wellenlänge des verwendeten Lichtes

A = numerische Apertur des Objektives und des Kondensors

Durch die richtige Einstellung des Kondensors schafft man die Möglichkeit für eine Ausnutzung einer hohen numerischen Apertur im Objektiv.

Definition der Vergrößerung

Die Gesamtvergrößerung eines Mikroskops V ist gleich dem Produkt aus Objektivvergrößerung V_objund der Okularver- größerung V_ok mit dem Tubusfaktor T

V = V_obj ∙ V_ok ∙ T

2. Praktische Einführung in die wissenschaftliche Zeichentechnik

Übersichtszeichnungen (ÜZ)

Schematische Skizze. Darstellung der Lage und Ausdehnung der Gewebe in einem Organ oder Organteil nur in Umrissen. Keine Zeichnung von einzelnen Zellen!

Detailzeichnung (DZ)

zellgetreue Wiedergabe von Gewebeausschnitten (maßstab- und formgetreu)

Zeichentechniken

Einstrich – Zeichnentechnik: Zellwände zwischen zwei Zellen werden nur mit einem Strich dargestellt - für Gewebe aus Zellen mit dünnen Zellwänden.

Zweistrich – Zeichnentechnik: Zellwände zwischen zwei Zellen werden mit zwei Strichen dargestellt - für Gewebe aus Zellen mit verdickten Zellwänden.

Dreistrich – Zeichnentechnik: Zeichnung benachbarter Zellen mit dreifacher Linienführung. Als Hilfslinie wird die Mitte zweier benachbarter Zellen benützt (=Mittellamelle), anschließend trägt man die Primär- bzw. Sekundärwand ein - für Gewebe mit dickwandigen und dünnwandigen Zellen.

Beschriftung von wissenschaftlichen Zeichnungen: Eine wissenschaftliche Zeichnung ohne Beschriftung ist wertlos! Die Beschriftung ist die wissenschaftliche Interpretation des Beobachteten! Wichtige Details werden durch beschriftete Pfeile hervorgehoben und eingeordnet. Zur Beschriftung gehört auch ein Titel mit dem Namen des Objekts (Was für eine Art, welche Familie, welche Art von Gewebe/Zellen, welche Art von Präparation) und Angaben zur Größe (Vergrößerung oder Maßstabsbalken).

3. Präparat 1: Epidermis der Küchenzwiebel

Epidermiszelle der Küchenzwiebel (Allium cepa - Alliaceae). Detailzeichnung einer Zelle.

Vorgehen: man bereite einen Objektträger mit einem Tropfen Wasser vor, nehme ein fleischiges Schuppenblatt der hellen Küchenzwiebel mit der konkaven (eingewölbten) Innenseite nach oben und ritze mit der Rasierklinge oder dem Skalpell ein Viereck ein. Mit einer feinen Pinzette fährt man nun unter das Häutchen (die Epidermis), ergreift eine Ecke und zieht das Häutchen gleichmäßig und langsam ab, spreitet es auf dem Wassertropfen und legt vorsichtig ein Deckglas auf. Nun kann mikroskopiert werden. Nach dem ersten Mikroskopieren kann man noch mit Hämatoxylin anfärben, damit die Zellkerne besser zu sehen sind.

Was ist zu sehen? Die typische Form von epidermalen Zellen. Wenn man die Kondensorblende relativ weit schließt, kann man den zumeist am Rand liegenden Zellkern und den Cytoplasmasaum sehen, manchmal auch transvacuolare Plasmasträngen. Der Großteil des Zellinneren ist jedoch Vacuole. Bei schonend präparierten Zellen sieht man noch die Plasmaströmung im randständigen Cytoplasmasaum und den Plasmasträngen. Hier sind mit etwas Glück noch kleine Organellen zu erkennen, beispielsweise Mitochondrien (dunkel, wurstförmig), Oleosomen (dunkel, rund) und Leucoplasten (hell, eher trapezförmig).

Aufgabe: Zählen Sie aus, wieviel Zellen jeweils aneinander grenzen (3, 4, 5,....) und formulieren Sie eine mögliche Erklärung dafür.

4. Präparat 2: Histochemie von Kartoffelstärke

Stärkehaltiges Parenchym (Grundgewebe) aus der Sprossknolle der Kartoffel (Solanum tuberosum - Solanaceae). Anfärbung und Detailzeichnung.

Vorgehen: man suspendiert etwas Kartoffelstärke (kann auch aus einer durchgeschnittenen Kartoffelknolle mit einer Nadel oder einem Skalpell etwas Gewebe gewonnen werden). Nach Zeichnung im Hellfeld wird ein Tropfen Lugolsche Lösung (Jod-Jodkalium-Lösung) seitlich neben dem Deckglas aufgesetzt und mithilfe eines Streifens Filterpapier (oder Küchenkrepp) durch das Präparat gezogen. Unter Umständen muss man die Lugolsche Lösung vorher noch verdünnen.

Was ist zu sehen? Die Stärke wird in stärkespeichernde Plastiden (Amyloplasten) enthalten. Im Hellfeld kann man bei geschlossener Kondensorblende oft die Schichtung erkennen. Nach Färbung mit Lugolscher Lösung färbt sich die Stärke (Amylose) tiefblau.

Demonstration

Im Dunkelfeld leuchten die Stärkekörner oft prächtig auf, im polarisierten Licht entstehen aufgrund der Schichtung (Stärke ist ein langgestreckter Dipol) charakteristische Kreuzmuster (Malteserkreuz).

Zur Nachbereitung

Weiterführende Informationen zur Mikroskopie:

http://www.mikroskopie-fuer-anfaenger.de/

http://www.mikroskopie.de/

Nultsch / Grahle: Mikroskopisch-Botanisches Praktikum für Anfänger, Kapitel 1 (Thieme Verlag)

Weiterführende Informationen zur pflanzlichen Zelle:

Nultsch / Grahle: Mikroskopisch-Botanisches Praktikum für Anfänger, Kapitel 2 (Thieme Verlag)

Lüttge / Kluge / Bauer: Botanik, Kapitel 5 (Wiley Verlag)