Chromoplastenhaltiges Parenchym aus dem Fruchtfleisch (Perikarp)
der unreifer und reifer Tomaten (Solanum lycopersicum –
Solanaceae).
Querschnitt, Detailzeichnung.
Was ist zu
sehen? Das Perikarp besteht aus stark vakuolisierten
parenchymatischen Zellen (Grundgewebe). Im unreifen Zustand sind in der
Zellperipherie grüne Chloroplasten zu erkennen und die Zellen grenzen
durchgängig aneinander. Im reifen Zustand haben sich die Chloroplasten
vollständig in Chromoplasten umgewandelt, die orange bis rot erscheinen, weil
sie viel Carotinoide (vor allem Lycopin) akkumuliert haben. Beim Reifen wird das
Enzym Polygalacturonidase induziert, das nun die Mittellamelle auflöst. Dadurch
runden sich die Zellen etwas ab und rücken auseinander. Die entstehenden
Interzellularen sind dafür verantwortlich, dass das Gewebe lockerer wird. Dieses
"Matschigwerden" hat den biologischen Sinn, die Samen im Innern der Tomatenbeere
freizusetzen, ist aber für Transport und Verkauf der Tomaten von Nachteil. Bei
der Antimatschtomate wird daher die Produktion der Polygalacturonidase
unterdrückt, so dass das Perikarp länger fest bleibt. Dadurch können die Tomaten
länger auf der Pflanze belassen werden, wodurch die Bildung von Carotinoiden und
Aromastoffen weiter fortschreiten kann. Durch neuartige Erntetechniken (sogenannte
Strauchtomaten) wird jedoch dasselbe erreicht, so dass die Antimatschtomate nur
noch gelegentlich in USA und Großbritannien im Handel zu finden ist.
2. Pflanzliche Gewebekultur:
Tabaklinie VBI-0
Dedifferenzierte Kalluszellen
aus Markparenchym von Tabak (Nicotiana tabacum, cv. 'Virginia Bright
Italia (VBI-0)' - Solanaceae). Übersichtszeichnung eines Zellfadens,
Detailzeichnung und Quantifizierung.
Durchführung: Tabakgewebe
ist sehr regenerationsfreudig - wenn man Gewebsstückchen auf Agarplatten bringt,
die das Pflanzenhormon Auxin und Zucker als Kohlenstoffquelle enthalten,
entsteht leicht und schnell ein sogenannter Kallus. Das sind weitgehend
differenzierte Zellen, die sich intensiv teilen. Wenn man solche Kalli mit
Cytokininen behandelt, regenerieren zahlreiche kleine Pflänzchen (sogenannte
somatische Embryogenese). Aufgrund seiner Regenerationsfreudigkeit war Tabak
die erste Pflanze, die gentechnisch verändert werden konnte. Dazu wird einfach
Kallus mit Agrobacterium tumefaciens kokultiviert, dem vorher das Gen von
Interesse in die T-DNS eingesetzt wurde. Bei der Zellkultur muss steril
gearbeitet werden (warum wohl?). Die im Kurs benutzten Kallusplatten werden
hinterher aber ohnehin verworfen, können also unter unsterilen Bedingungen
geöffnet werden. Man entnimmt eine Spatelspitze Kallus und verrührt ihn
vorsichtig mit Kulturmedium (Murashige-Skoog oder MS-Medium, eine mineralische
Mischung, die alles enthält, was eine Pflanzenzelle zum Leben braucht). Wenn die
Zellfäden zu dicht sind, muss die Suspension mit mehr Medium vermischt werden,
so dass nicht zu viele Zellfäden übereinander liegen. Zunächst wird von einem
einzelnen, freiliegenden Zellfaden eine Übersichtszeichnung angefertigt und dann
eine einzelne Zelle gezeichnet. Durch Schliessen der Kondensorblende treten die
Cytoplasmafäden zutage, an denen der Zellkern im Innern der Vacuole aufgehängt
ist. Danach wird eine sogenannte Häufigkeitsverteilung der Zellzahl angefertigt
- man zählt dabei, wieviele Fäden aus 1, 2, 3, 4, usw. Zellen bestehen. Die
Ergebnisse werden für alle Kursteilnehmer aufaddiert und in Prozent umgerechnet.
Dieser relative Anteil (die Häufigkeit) wird gegen die Zahl von Zellen pro Faden
aufgetragen.
Was ist zu sehen? Der
Kallus besteht aus einem Gewirr von mehrzelligen Fäden, die Teilung und das
Wachstum der Zellen erfolgt genau in einer Achse, die, wie wir inzwischen
wissen, durch einen Fluss des Pflanzenhormons Auxin ausgerichtet wird. Die
Zellen "erinnern" sich an ihren Ursprung und durchlaufen ein einfaches
Entwicklungsprogramm wie es bei der Differenzierung von Markparenchym zu
Leitbündelgewebe stattfindet. Im Detail sieht man, dass der Zellkern vom Rand in
die Mitte gerückt ist. Zahlreiche Cytoplasmastränge scheinen den Zellkern an
dieser Position zu verankern. Das Innere ist jedoch weitgehend durch die Vacuole
ausgefüllt, die Cytoplasmastränge durchziehen die Vacuole tunnelartig und müssen
aktiv durch Energieerzeugung gegen den Vacuolendruck aufrechterhalten werden -
hierfür ist das pflanzliche Cytoskelett (Mikrotubuli und Actinfilamente)
verantwortlich, dass die Struktur der Cytoplasmastränge aufrechterhält. Die
Zellen eines Fadens erscheinen auf den ersten Blick als unabhängige und autonome
Einheiten. In der Tat bilden sie jedoch einen einfachen Organismus - dies zeigt
sich, wenn man eine Häufigkeitsverteilung der Zellzahl pro Faden erstellt. Dabei
wird eine wellenartige Verteilung sichtbar - geradzahlige Fäden sind häufiger
als ungeradzahlige. Diese "Wellen" zeigen, dass die Zellteilung innerhalb eines
Fadens synchronisiert wird.
3
.
GUS-Reporterlinien beim Reis
Präparat 3:
Koleoptilen von
transgenen Reiskeimlingen (Oryza sativa ssp. japonica
– Poaceae), die ein Promotor::GUS Konstrukt für ein Jasmonsäure-Synthesegen
exprimieren. Übersichtszeichnung.
Durchführung:
Promotor-GUS-Studien sind ein häufig eingesetzter Weg in der Molekularbiologie,
um feststellen zu können, in welchen Zellen oder Geweben ein bestimmtes Gen
aktiv ist. Dazu wird der Promotor des Gens kloniert und vor eine Sequenz
fusioniert, die für das Enzym
b-Glucuronidase
(GUS) kodiert. Dieses Enzym kommt in Pflanzen nicht vor und setzt das künstliche
Substrat X-GlcA zu einem blauen Farbstoff um. Nun wird das Fusionskonstrukt in
die Pflanze von Interesse eintransformiert und Samen dieser transgenen Linie
gezogen. In den Keimlingen, die aus diesen Samen entstehen wird durch die
Anfärbung in allen Zellen, in denen der Promotor aktiv war und GUS produziert
hat, eine Blaufärbung sichtbar. Das sind also die Zellen oder Gewebe, in denen
das entsprechende Gen angeschaltet wird. In unserem Fall interessieren wir uns
für die Allenoxycyclase, ein Enzym des Jasmonatsynthesewegs. Jasmonsäure ist
nicht nur der Duftstoff des Jasmins, sondern, wie man inzwischen weiß, ein
wichtiges Pflanzenhormon, das vor allem für die Abwehr von Krankheiten und als
"Schmerzsignal" bei Verwundung wichtig ist. Unsere Forschungen ergaben nun
überraschenderweise, dass dieses Hormon auch in Antwort auf Licht gebildet wird.
Daher verwenden wir in unserem Versuch zum einen dunkelgewachsene Keimlinge und
Keimlinge, die für einige Stunden mit Blaulicht bestrahlt wurden. Um sichergehen
zu können, dass die Blaufärbung nicht "von selbst" entsteht, z.B. durch
unspezifische Reaktionen im Reisgewebe, die nichts mit der GUS zu tun haben,
wird natürlich auch eine sogenannte Negativkontrolle mitgefahren, bei der man
einfach nicht transgene Pflanzen (sogenannte Wildtypen) anfärbt. Aus Zeitgründen
werden im Kurs schon vorgefärbte Keimlinge zur Verfügung gestellt. Das Verfahren
der Färbung wird hier jedoch beschrieben:
Lösungen
100 mM Phosphatpuffer: 17,8 g/l Na2HPO4
x 2 H2O, pH 7,0 (mit H3PO4),
1 % X-GlcA: 100
mg X-GlcA in 10 ml DMF,
5 % Na-Azid:
500 mg Na-Azid in 10 ml ddH2O,
X-GlcA-Färbelösung (50 ml)
Färbelösung (wird frisch aus den Stammlösungen in ein 50-ml
Falcon-Röhrchen gemischt): 46.5 ml 100-mM Phosphatpuffer mit 2.5 ml
X-GlcA-Lösung, und 1 ml Na-Azidlösung
Durchführung der Färbung
Die Keimlinge werden für 2 Tage bei 37°C im
Brutschrank mit etwa 25 ml Färbelösung inkubiert. Danach wird die Farbelösung
durch 70% EtOH ersetzt und bei 65°C für mindestens 1 Stunde inkubiert. Danach
können die Präparate bei Raumtemperatur bis zur Auswertung gelagert werden.
Was ist zu sehen:
Die Koleoptile
ist ein embryonales Organ der Gräser (zu denen auch die Getreide
zählen), dass die Aufgabe hat, die empfindlichen Blätter
unverletzt an die Erdoberfläche zu bringen. Die Koleoptile wächst
schnell und findet ihren Weg, indem sie sich an der Schwerkraft
und dem ins Erdreich eindringenden Licht orientiert. In dem
Augenblick, wo sie das Licht erreicht, stellt sie das Wachstum ein
und wird von den Blättern durchstossen. Genauere Beobachtungen
zeigen, dass dieses "Durchstossen" kein gewaltsamer Vorgang ist,
sondern genau vorprogrammiert ist. Die Koleoptile öffnet sich
entlang einer Naht und wir vermuten, dass dies dadurch geschieht,
dass die Zellen der Naht durch das Jasmonatsignal dazu gebracht
werden, sich gezielt umzubringen (sogenannter Programmierter
Zelltod, die pflanzliche Version der sogenannten Apoptose). Bei
Koleoptilen, die mit Blaulicht bestrahlt wurden, ist die
Blaufärbung viel stärker und über das Gewebe verteilt. Hier wird
also die Bildung von Jasmonat verstärkt, was mit einer schnelleren
Öfnnung der Naht einhergeht. Bei der Negativkontrolle sollte keine
Farbreaktion zu finden sein - obwohl diese Kontrolle auf den
ersten Blick langweilig erscheint, ist sie sehr wichtig - nur so
kann man sicher sein, dass die Blaufärbung bei den anderen Proben
auch wirklich auf das eintransformierte Transgen zurückzuführen
ist.
Zur
Nachbereitung
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