Schnupperpraktikum Molekulare Zellbiologie

Übersicht Klausurtermine WS 2008-2009

Stundenpläne

6. Semester: hier gibt es keine Stundenpläne, das Modul 0008B findet als Block zwischen 5. und 6. Semester statt, das Modul 0011C als einwöchiger Block im selben Zeitraum, das Modul 0009 als Block im 6. Semester

Molekulare Zellbiologie der Pflanzen (AG Nick)

Anhand einer konkreten Fragestellung aus laufenden Forschungs-Projekten wird in die Denk- und Arbeitsweise der molekularen Zellbiologie der Pflanzen eingeführt. Es soll das im Rahmen des Seminars (Modul 0004C) entwickelte Versuchskonzept praktisch umgesetzt werden.

Fragestellung: Licht ins Dunkle der Actin-Tubulin Interaktion

Actinfilamente und Mikrotubuli müssen miteinander wechselwirken. Dies leuchtet ein, aber über die Art dieses Zusammenwirkens weiss man sehr wenig. Außerdem sind in Pflanzenzellen manche Aufgaben von Actin und Mikrotubuli anders zugeordnet als in den intensiver untersuchten tierischen Zellen. Die Mikrotubuli sind während der Interphase in parallelen Bündeln organisiert, deren Ausrichtung für die Achse des Zellwachstums wichtig sind. Die Richtung der Mikrotubuli kann sich abhängig von Umweltsignalen (z.B. dem Pflanzenhormon Auxin oder Licht) verändern. Auch bei der Zellteilung kommt es immer wieder zu dramatischen Richtungsänderungen, die für den Aufbau der mitotischen Strukturen wichtig sind. Diese Richtungsänderungen werden nicht durch eine "Drehung" bewirkt, sondern durch Abbau "falsch" orientierter und Aufbau "richtig" orientierter Mikrotubuli. Wer gibt diese Richtung vor? Möglicherweise die Actinfilamente.

Eine spannende, neue Entwicklung in diesem Feld sind Berichte aus tierischen Zellen, dass Proteine, die an das wachsende Plusende von Mikrotubuli binden mit Actinbindeproteinen komplexieren. Das bedeutet also, dass Actinfilamente direkt auf die Mikrotubuli-Stabilität einwirken können.

Es muss also Proteine geben, die sowohl an Actin als auch an Mikrotubuli binden und diese möglicherweise gegeneinander verschieben können. Wir haben ein solches Protein isolieren können, ein unkonventionelles Kinesin, OsKCH1 (Os steht für Oryza sativa L., also Reis). Dieses Kinesin besitzt eine Actinbindedomäne und es wandert vermutlich zum Minuspol der Mikrotubuli (verhält sich also eher wie ein Dynein). Da diese Kinesingruppe nur bei Pflanzen vorkommt, ist sie auch evolutionsbiologisch interessant. Der Phänotyp von Reismutanten, bei denen OsKCH1 durch Insertion des Retrotransposons Tos17 inaktiviert ist, deuten auf eine Rolle bei der Zellteilung hin. Zellteilung in Reispflanzen zellbiologisch zu untersuchen, ist sehr schwierig. Das Eine Tabakzell-Linie, bei der OsKCH1 als Fusion mit GFP überexprimiert wurde, zeigt dementsprechend eine verzögerte Zellteilung. Problem bei diesen Untersuchungen ist jedoch, dass man hier ein heterologes System hat (Reisgen in Tabakzelle).

Inzwischen konnte das Tabakhomolog von OsKCH1, also NtKCH1 (Nt steht für Nicotiana tabacum L, also Tabak), kloniert werden. Damit ist nun der Weg frei für die Untersuchung im homologen System (Tabakgen in Tabakzelle). Im Rahmen des Schnupperpraktikums geht es nun um die Frage, was die mögliche von NtKCH1 sein könnte.

Welche Werkzeuge stehen zur Verfügung?

Tabaklinien

Transgene Tabak-BY-2 Linien, bei denen verschiedene Elemente des Zellskeletts über fluoreszente Proteine markiert sind (Actinfilamente, Actinbindeproteine, Mikrotubuli, Mikrotubuli-Plusenden, OsKCH1)
Transgene Tabak-BY-2 Linien, bei denen Actinfilamente durch Überexpression von Bündelungsproteinen stabilisiert sind. Durch Zugabe von natürlichem Auxin (Indolyl-3-Essigsäure) kann man diese Bündelung wieder aufheben.

Konstrukte

Verschiedene Konstrukte von OsKCH1 (volle Länge, nur Kinesin-Motordomäne, nur Actinbindedomäne) in Fusion mit fluoreszenten Reportern in einem GATEWAY-Vektor.
Den Mikrotubuli-Plusendmarker EB1 in Fusion mit fluoreszenten Reportern, den man dazu benutzen kann, das Wachstum von Mikrotubuli-Polen sichtbar zu machen.
Den Transkriptionsfaktor CPRF2 in Fusion mit CFP, den man also Indikator für eine erfolgte Transformation einer Zielzelle benutzen kann (bei transformierten Zellen leuchtet dann der Zellkern auf).
RNai-Vektoren für NtKCH1 für transiente Transformation (Biolistik)

Spezielle Geräteausstattung

Konfokales Laser-Raster-Mikroskop und Apotom
Partikelkanone für transiente Transformation
Infrastruktur für pflanzliche Zellkultur

Hintergrundinformation

Ein Übersichtsartikel über Funktion und Mechanismus der Mikrotubuli-Orientierung (Nick 2008)

Eine kurze Beschreibung des KCH1-Projekts

Eine Originalarbeit über die Nutzung von YFP-mT als Werkzeug zur Manipulation von Actin (Maisch und Nick 2007)

Eine Originalarbeit über die Isolierung und Charakterisierung von OsKCH1 (Frey et al. 2009)